打算开个新的专题，讲讲我的final year project，这也算是我第一个实际意义上的research experience吧。做完final year project之后一直很想讲讲这个部分的内容，但又是final exam又是托福的，就一直没时间，到现在终于放假了就来写写吧，每天码几个字，持续更新hhhh:-) ——2023.12.23
首先是我final year project的题目——Investigation of the Apoptotic Effects of Metformin: Potential for Anti-cancer Drug Development (二甲双胍细胞凋亡效应的研究：潜在抗癌药物的研发)。
为什么选这个题目呢？因为当时就提供四个大的方向给我们选：1.Microbiology; 2. Cell and Cancer Biology; 3. Clinical Chemistry; 4. Molecular Technique。既是如此，我就想着选个挑战性高的（据说只给一瓶cell line，养死了project就玩完了），实验课中接触少的，多学一点是一点吧，嘿嘿，而且Cancer biology恰恰是我很感兴趣的方向。于是在我的怂恿下，另外三位内地生也选了这个topic，其他local的学生就没有人把这放first choice的😂。
点这看outline↑
在supervisor的建议下，题目就大致定为Investigation of the apoptotic effects of [synthesized drug/natural compound]: potential for anti-cancer drug development. 这其实算是挺热门的研究，就是把已有的其他病的合成药或者什么化合物拉过来，看它杀不杀癌细胞。如果确认其有抗癌性，最棒的情况甚至可以直接把这药用到癌症治疗上。而且！！因为这些药都已经上市了，毒性机理都很清楚，几乎不用临床试验(一般新药的临床试验都得数十年)，简直是居家旅行，省时省力，省钱省心，必备良方😀
二甲双胍(Metformin)，出了名的糖尿病药。我当时选二甲双胍这药也是挺意外的。我当时想既然要选个“也许有抗癌潜力的合成药”，总得先看看之前的相关研究吧。总不能找个和癌症机理八竿子打不着的药研究其抗癌性吧😂 于是几篇二甲双胍有可能具有抗癌潜力的论文映入眼帘。我想着，二甲双胍，这不是出了名的糖尿病药吗🤔 连我爷爷都知道，他每天要吃几粒二甲双胍。它具有抗癌性？不过确实有不少研究有表明。好了，那就它了，和癌症听上去没啥关系，但又似乎有抗癌性的，二甲双胍。
HT-29 cell line 和 CAL-1 cell line。这俩是本project所用的细胞系。一开始我想着要搞二甲双胍，那就找个听着很相关的胰腺癌的细胞系(pancreatic cancer cell line)吧。你听听，二甲双胍，糖尿病，胰腺，胰腺癌，看上去多相关啊😆 而且胰腺癌不是被称为癌症之王吗😏 但不巧了，胰腺癌细胞系比较少见，实验室刚好没有😳 Supervisor就将其换成HT-29 cell line，是一种结直肠癌细胞系(Colorectal cancer cell line)。后来想想，二甲双胍除了作用在肝，尤其是糖异生，也作用在肠呀，那肯定能有些关联的。有了癌细胞系(cancer cell line)，在我强烈要求抗议下，supervisor只好又给了我正常细胞的细胞系(normal cell line)，CAL-1，一种树突细胞的细胞系，作为对照组。
除了二甲双胍，我还用了一种已知的抗癌药作为阳性对照(positive control)——5-氟尿嘧啶(5-FU)，这是出了名的化疗药，毒性极强，对结直肠癌有奇效，真可谓是杀人灭口，杀癌灭瘤，必备良药😀 用它作为阳性对照，比较二甲双胍的抗癌效果再适合不过了。看哪，这小小一瓶10g就要三百多美刀哩😇
好了，背景讲得差不多了，该开始讲正题了。balabala那么久还没开始讲我怎么做实验。。本想着按我论文的方法和结果讲，但想想还是按照实验的时间顺序讲吧，这样显得好玩又真实(bushi（其实就是单纯懒得再去翻论文🤣
一开始，我们每人各获得了一瓶HT-29细胞，大概长这样，HT-29细胞长成一层附着在底面上，然后浸在培养基里，如果细胞挂了就会浮在培养基里。当时已经传到第六代了。至于CAL-1细胞那是刚从-80℃解冻出来的，就从第一代开始传（CAL-1细胞不一样，不是附着在底部，而是浮在培养基里长的）。我们就先熟悉一下传代培养(sub-culture)的流程，于是。。短短一周内HT-29细胞就进入了第九代，变成四瓶（这样即使有瓶被污染挂了，其他还有三瓶哩，hhhh我真是冰雪聪明(bushi，←这人可能有什么大病，每瓶细胞那么少就强行传代
此乃RPMI1640培养基，专业培养细胞五十余年
细胞传代培养(cell sub-culture)的流程其实挺简单的，主要目的就是换一下培养基，让细胞吃得饱，睡得好
还有就是分到新瓶，一瓶变两瓶，两瓶变四瓶，越长越多（爸妈再也不用担心我的细胞会挂掉嘿嘿。HT-29细胞是贴壁长的，旧培养基取出来后细胞是一层粘在壁上的，这时候就要用到胰蛋白酶-EDTA溶液(trypsin-EDTA solution)，让它脱离(detach)，然后再去离心一下分离出来，再洗一洗，再加入新培养基，最后移到新瓶就大功告成了！(这都写的啥啊，确定非本专业的看得懂吗
哎，这个反正就是让细胞健康快乐成长的方法啦，细胞如果都gg了还做个鬼实验。
细胞传代培养(cell sub-culture)的流程其实挺简单的，主要目的就是换一下培养基，让细胞吃得饱，睡得好 还有就是分到新瓶，一瓶变两瓶，两瓶变四瓶，越长越多（爸妈再也不用担心我的细胞会挂掉嘿嘿。HT-29细胞是贴壁长的，旧培养基取出来后细胞是一层粘在壁上的，这时候就要用到胰蛋白酶-EDTA溶液(trypsin-EDTA solution)，让它脱离(detach)，然后再去离心一下分离出来，再洗一洗，再加入新培养基，最后移到新瓶就大功告成了！(这都写的啥啊，确定非本专业的看得懂吗
哎，这个反正就是让细胞健康快乐成长的方法啦，细胞如果都gg了还做个鬼实验。
此乃RPMI1640培养基，专业培养细胞五十余年
关于RPMI1640培养基，这里再补充几句。这里拿到这样一瓶的是基本培养基(basal medium)。但要培养细胞肯定是远远不够的，里面还得加点补充。一般里面会加胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)和抗生素(antibiotics，用的是青霉素+链霉素溶液，Penicillin-Streptomycin Solution)。胎牛血清含有生长因子(growth factor)和细胞因子(cytokine)，这样细胞就能噌噌噌地长💨；抗生素呢就是防止细菌的污染。对HT-29细胞我是加了10%的FBS和1%的antibiotics；对CAL-1我还加了HEPES和2-Mercaptoethnol分别用来调pH和抗氧化。
CAL-1细胞培养基配方
讲完怎么培养细胞，就该讲讲怎么拿细胞做实验了。
首先，细胞从培养基取出来后是以细胞悬液(cell suspension)的形式存在的，就是一管培养基里面漂着细胞🧪 那第一个遇到的问题就是这管悬液大概有多少细胞，即细胞密度(cell density)。如何确定细胞密度呢，总不能拿显微镜一个一个数吧，这一管细胞少说几百万甚至可能几亿个😂 但真就是拿显微镜数的，不过是有方法的——台盼蓝排斥试验(trypan blue exclusion test)。先取一小点细胞悬液出来，我习惯是取20μl，然后加等量的台盼蓝（这样比较好算，数完乘2就行），接着把它打到血细胞计数板(hemocytometer)里面，放显微镜数就能大致估计了。
血细胞计数板我记得好像高中生物有讲过，大概就如图所示，显微镜下看就是一堆格子。这玩意的规格是全球统一的，标1234的这几个正方形边长为1mm，各处的厚度都是0.1mm，所以这每个大正方形所对应的体积为0.1μl。我一般就数1234每个正方形里细胞的数量，取个平均，换算下单位，乘稀释倍数，就能算出每毫升悬液大概多少细胞了。公式如下：cell density (n/ml) = [(n1+n2+n3+n4)/4] × 104 × 2。104是因为1ml = 0.1μl × 104，2是因为我加了等量台盼蓝稀释。（怎么感觉越说越复杂🤣，反正数完套公式就是了(*^_^*)
既然是用血细胞计数板数的，那细胞悬液直接打到计数板不一样能数吗，为啥要加台盼蓝？确实能数，但问题是分辨不出死细胞。台盼蓝可以穿透死细胞的细胞膜，把细胞染成蓝色，但活细胞就不会被染。如图，你能看到活细胞，一个个跟泡泡似的，但还是能看到一两个染成蓝的死细胞。那数的时候当然不能数死细胞了😗 这就是为什么这方法叫exclusion test，就是把死细胞exclude了。
首先，细胞从培养基取出来后是以细胞悬液(cell suspension)的形式存在的，就是一管培养基里面漂着细胞。那第一个遇到的问题就是这管悬液大概有多少细胞，即细胞密度(cell density)。如何确定细胞密度呢，总不能拿显微镜一个一个数吧，这一管细胞少说几百万甚至可能几亿个
但真就是拿显微镜数的，不过是有方法的——台盼蓝排斥试验(trypan blue exclusion test)。先取一小点细胞悬液出来，我习惯是取20μl，然后加等量的台盼蓝（这样比较好算，数完乘2就行），接着把它打到血细胞计数板(hemocytometer)里面，放显微镜数就能大致估计了。
血细胞计数板我记得好像高中生物有讲过，大概就如图所示，显微镜下看就是一堆格子。这玩意的规格是全球统一的，标1234的这几个正方形边长为1mm，各处的厚度都是0.1mm，所以这每个大正方形所对应的体积为0.1μl。我一般就数1234每个正方形里细胞的数量，取个平均，换算下单位，乘稀释倍数，就能算出每毫升悬液大概多少细胞了。公式如下：cell density (n/ml) = [(n1+n2+n3+n4)/4] × 104 × 2。104是因为1ml = 0.1μl × 104，2是因为我加了等量台盼蓝稀释。（怎么感觉越说越复杂，反正数完套公式就是了(*^_^*)
既然是用血细胞计数板数的，那细胞悬液直接打到计数板不一样能数吗，为啥要加台盼蓝？确实能数，但问题是分辨不出死细胞。台盼蓝可以穿透死细胞的细胞膜，把细胞染成蓝色，但活细胞就不会被染。如图，你能看到活细胞，一个个跟泡泡似的，但还是能看到一两个染成蓝的死细胞。那数的时候当然不能数死细胞了
这就是为什么这方法叫exclusion test，就是把死细胞exclude了。
MTT试验(MTT assay)或MTS试验，这玩意儿应该叫细胞存活率分析(cell viability test)。原理大概就是活细胞里线粒体上的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C还有活性，会把四唑(tetrazolium)还原成紫色的甲䐶(formazan)，然后测一下吸光度(absorbance)就大概知道细胞存活的水平了。MTS试验也是差不多的原理，但操作上比传统的MTT简单好多，只要往细胞里加MTS溶液，培养个三四小时测吸光度就行了。细胞存活率越高，颜色越深，吸光度越高。细胞存活率的计算就用实验组的吸光度除空白对照的吸光度就行了。
此乃96 well plate，中文应该是叫96孔板吧
MTS试验的具体实验操作就是先把细胞接种到96孔板上，加药，培养24或48或72小时，拿出来加MTS溶液，过个三四小时测吸光率。←听上去灰常简单的亚子😂 但具体实验操作时各种问题一股脑地涌来😅 每个孔细胞要加多少？加药的浓度多少？药要用什么溶解？加药之后细胞密度是不是被稀释了？药加到细胞培养基里浓度是不是也被稀释了？要培养24还是48还是72小时？……
- 先解决第一个问题“每个孔细胞要加多少？”，Protocol上建议的范围是1×103 – 1×105 cell/well，但这范围还是有点太广了，怎么办，做实验呗😗 我梯度稀释出来了4个细胞密度1×105, 5×104, 2.5×104, 1.25×104 cell/ml，取100μl加到孔里，那细胞密度就分别是1×104, 5×103, 2.5×103, 1.25×103 cell/well了。先拿这几个细胞密度做实验，选出效果最好的，之后沿用就行嘿嘿。
- 至于“加药的浓度多少？”，我先拿先前研究论文上的浓度试试，之后反正得扩大范围的，于是我经计算第一次实验设置了15mM, 7.5mM, 3.75mM, 和0mM四组浓度的二甲双胍。
- 我第一次是用蒸馏水溶解的药（但后来想想，细胞这次没被我搞死可真是命大😇，“药要用什么溶解”的问题之后确实困扰了我好久。
- 因为细胞密度是按每个孔多少细胞算的，加药之后每个孔还是那么多细胞，没变。
- 药加到培养基里当然被稀释了，所以实验前计算一定得考虑周全🤣
- 开局先快速积累点数据，所以首选24小时，之后没啥效果再延长时间咯
于是第一次MTS试验开始了，其实这才实验的第二天就赶鸭子上架了，反正先试一下失败了后面还有时间。。这次一共搞了32个孔，就是4个细胞密度，4个二甲双胍浓度，然后每孔重复，就是4×4×2，32个孔了，阳性对照5-FU没有做，还有CAL-1细胞也没有做。。主打一个试探🤔 先看看二甲双胍对HT-29细胞有没有作用😁 实验结果如表，就不拿原始数据出来混淆视听了哈🤣
看这实验操作，主打一个浪费板子😅
正常来讲药的浓度越高，细胞会死得越多，但如果细胞密度太高或太低就会很不准，甚至没有这个趋势。如上表，数据比较完美的就只有1×104, 5×103 cell/well两个细胞密度。所以我就选择1×104 cell/well，之后的MTS全用这个细胞密度了，主要是数字整10比较好配hhhh
。这次实验看出了点趋势，但还没达到IC50值（细胞存活率50%时的药物浓度），所以应该扩大药物浓度范围再做实验。
第一周就做了这一次MTS，结果一般般，算是有拿到数据但有些瑕疵的实验🤔，不过实验流程算是熟悉了。经过各种养精蓄锐，培养细胞，准备第二周好好再做几次MTS。
第二周经过一番整顿，吸取经验，准备大干一场😏 因为正常细胞CAL-1的密度还不太够，所以实验就集中在HT-29细胞上。我扩大药物浓度范围，设置了6.25mM, 12.5mM, 25mM, 50mM四个浓度，这次二甲双胍和5-FU都做。至于药物溶解嘛，我想了想用了PBS溶液🤣（就是这一举动导致这次MTS废了）PBS是一种缓冲液，主要成分就Na2HPO4，KH2PO4，NaCl之类的，洗细胞的时候一般用PBS溶液洗，我认为应该对细胞无害吧🙃，结果…… （摆上点实验数据瞧瞧吧
细胞除了那组啥都没加的空白对照，其他全死了。。只加PBS溶液的空白对照也死了（还好我当时多做了这组，算是揪出了原因。从这次MTS得到一个大大的教训：溶药就不能用PBS溶🤯！这组MTS算是废了，后面只能再重做了😓
于是当天我又准备了另一组MTS，这一次我准备了五个浓度，50mM, 25mM, 12.5mM, 20μM, 10μM。为什么突然冒出来两个那么低的浓度呢😶 因为现在不但做二甲双胍，也做5-FU了呀，据研究5-FU太毒了，差不多几十μM，细胞就死翘翘了，所以多做两组作为对照😬 那这次我用什么溶药呢？DMSO溶液（二甲基亚砜），说是无色无味无毒的有机溶剂，用来溶药应该挺合适的~
于是又等了一天，终于在第二周的周三等来了结果🧐
这结果应该不错，可以看出5-FU对癌细胞毒多了，对细胞一通咔咔乱杀，连那么低的浓度(10μM, 20μM)也有趋势；高浓度(50mM)的二甲双胍其实也不赖，不但癌细胞，连正常细胞也噶了😅
我把这次二甲双胍的数据和第一次MTS的数据整合了一下，得到了一张图表🤓 这张图我太喜欢了，简直奠定了我后面两周的实验思路。
如图可见，二甲双胍对HT-29细胞的IC50值应该在25mM，就是当二甲双胍浓度为25mM时HT-29细胞能死一半。但这浓度下正常细胞CAL-1也挂了快一半😅 所以后面的实验二甲双胍的浓度应该控制在10mM以内，不然正常细胞都挂了🥺。。但问题是小于10mM时，癌细胞HT-29它不死啊，存活率还有七八成🤣 点算啊。。。那就进行战略转移——延长时间，“以时间换空间”。24小时不死，就48小时、72小时，到时候只要CAL-1活得多，HT-29死得多就行了😎 我就不信延长时间HT-29还不死嘿嘿
其实我周三的时候又准备了一组MTS，周四得到结果，这组是针对低浓度的，主要是为了选取个合适的5-FU浓度。理论上50μl的5-FU已经非常毒了，但看结果细胞居然还有87.44%的存活率😲 但不管了，后面的流式细胞术的5-FU还是照50μM加。
第二周还剩两天，我安排了另一个实验——流式细胞术(flow cytometry)，用这技术来检测细胞究竟是凋亡(apoptosis)还是坏死(necrosis)（凋亡和坏死的区别，不懂的自己百度🤪）原本预定了周四的流式细胞仪(flow cytometer)，但没想到第二组MTS废了，只能拖一下改成周五了，但也算是在这周先熟悉一下流程。
流式细胞术(flow cytometry)，这玩意儿我想生物人应该都很熟悉。简单来说就是细胞一个一个这样流下来，然后有激光这样照每个细胞，然后根据散射的光用来确定每个细胞的特性😗 现在这技术已经发展到可以测量细胞的各种特性了，体积形态，DNA，RNA，蛋白质，表面抗原，细胞凋亡……甚至不是细胞都行，只要你想得到的，没有他办不到的，简直是生物研究的神兵利器⚔️
比较常见的用法就是给要检测的目标染色，让其接上个荧光基团，就相当于做记号📌 然后拿去流式细胞仪跑一下，有做记号的就通过散射的光检测出来了，附带的程序还能帮你算出有多少细胞有记号的，顺带连图都给你画出来😏
此乃实验室的流式细胞仪，已为CityU辛劳工作八九年👍
此乃Annexin V-FITC & PI Apoptosis Detection Kit，里面就500µl膜联蛋白V，500μl PI，一小瓶缓冲液。一袋不用998，不用888，只用710美刀🤑
我要检测的细胞凋亡，所以我用的是Annexin V-FITC & PI Apoptosis Detection Kit（膜联蛋白V连FITC和碘化丙啶细胞凋亡检测盒，中文读得真不顺口🤣）
活细胞的细胞膜内面有种东东叫PS（Phosphatidylserine，磷脂酰丝氨酸），这玩意在细胞凋亡早期的时候会从膜的内面给移出来。而膜联蛋白V（插嘴一句，这个念“膜联蛋白五”），恰恰能连到PS上；所以这时候用一个连着荧光基团FITC的膜联蛋白V就能检测细胞是否到了凋亡阶段了😗
但单单连着荧光基团的膜联蛋白V还只能检测细胞挂没挂，这时候再加上PI（propidium iodide，碘化丙啶）就能进一步区分凋亡和坏死了。PI能够染细胞的DNA🧬，但如果细胞还活着PI穿透不了细胞膜，染不了DNA；只有当细胞处于凋亡后期，或者坏死了，细胞膜破了，才有可能染到。
所以，膜联蛋白V阴，PI阴→细胞活着；膜联蛋白V阳，PI阴→凋亡早期；膜联蛋白V阳，PI阳→凋亡晚期或坏死；膜联蛋白V阴，PI阳→坏死。（嗯~ o(*￣▽￣*)o 反正都阴就是活着，🐏了就是要挂或者挂了😇
流式细胞术需要有一定量的细胞，96孔板太小了不够，一般是把细胞种到培养皿里然后加药培养。Supervisor给了我们一神器，6 well plate，相当于一块板上有六个小培养皿。
我沿用96孔板的思路，但体积给它扩大十倍，所以每个坑中放1×105个细胞。药的浓度呢，就按MTS的结果，选取了10mM二甲双胍和50μM 5-FU。
具体的实验操作就是细胞加到六坑板，药加到六坑板，培养个24小时（或48或72），然后收割(harvest, 这词用得太妙了)，就是把这个坑里无论活细胞死细胞全都洗出来，洗一洗，涮一涮，加膜联蛋白V和PI和缓冲液，之后就能跑流式细胞仪了😗
此乃6 well plate，中文管它叫六孔板我觉得不太恰当了，我提议应该叫六坑板😆
这六坑板我自己没拍照，找同学借的图👀
流式细胞术需要有一定量的细胞，96孔板太小了不够，一般是把细胞种到培养皿里然后加药培养。Supervisor给了我们一神器，6 well plate，相当于一块板上有六个小培养皿。
此乃6 well plate，中文管它叫六孔板我觉得不太恰当了，我提议应该叫六坑板😆
这六坑板我自己没拍照，找同学借的图👀
我沿用96孔板的思路，但体积给它扩大十倍，所以每个坑中放1×105个细胞。药的浓度呢，就按MTS的结果，选取了10mM二甲双胍和50μM 5-FU。
具体的实验操作就是细胞加到六坑板，药加到六坑板，培养个24小时（或48或72），然后收割(harvest, 这词用得太妙了)，就是把这个坑里无论活细胞死细胞全都洗出来，洗一洗，涮一涮，加膜联蛋白V和PI和缓冲液，之后就能跑流式细胞仪了
这操作流程听着简单，其实做起来繁琐得要命🙃 六坑板拿出来，要吸出旧培养基把死细胞离心分离出来，然后再用PBS洗一遍，再分离；活细胞又要用胰蛋白酶脱离，然后再离心分离出来，用完胰蛋白酶又要洗；板上残留的细胞还要再洗洗，再离心分离出来，怕洗不干净，再洗洗，再分离…… md，一个板六个坑，每个坑都这么操作，要收割到猴年马月啊😵
在收割细胞之前我自己又多加了一步——用显微镜检测细胞形态。加这步能让我论文多不少字哩😂 细胞在板里或在瓶里普通光学显微镜肯定是看不了的，所以用的是倒置显微镜(inverted microscope)。实验室有台公用的，还连着软件可以抓拍，我就每个坑都拍了一下。
这玩意儿其实功能强大，荧光啥的都拍（这其实是他的本职工作😂），现在想想，我当时怎么没想到染完之后用它拍荧光呢。。这样论文又能多好多内容🤨 当时只顾着做流式细胞术了
倒置显微镜大概长这样，实验室里的还连着台平板，能抓拍看到的图像📸
这是第一次细胞形态检测的实验结果，你可能会说，这也妹看出什么区别啊🙄 而且怎么看着空白对照的细胞好像还更少了。。这就对了，因为这次流式细胞术结果也是废的😅
这是第一次流式细胞术的结果，加药和不加药好像真没什么区别😅
对了好像得普及一下这图怎么看，，横轴是膜联蛋白V的信号，纵轴是PI的信号。所以左下角：都是阴，活细胞；右下角：膜联蛋白V阳 PI阴，凋亡早期；右上角：都是阳，凋亡晚期或坏死；左上角：膜联蛋白V阴 PI阳，坏死。
结果这次三组，活细胞的比例分别是99.96%，96.24%，99.44%，这TM有个鬼的区别啊啊啊🙂
也许是实验哪步出问题了，或者药物处理的时间不够长？看来加药还是得多参考参考MTS的结果，之后真得试试48和72小时的了。。。这次就当熟悉实验流程了。
第三周经过一番整顿，吸取经验，准备大干一场😏 （这话怎么听着有点熟悉）。于是——我准备了个计划——
周一：准备三组MTS，分别24，48，72小时；
周二：得到24小时MTS数据，准备一组48小时流式细胞术；
周三：得到48小时MTS数据；
周四：得到72小时MTS数据，做48小时组流式细胞术
周五：准备一组72小时流式细胞术
……
下周一：做72小时组流式细胞术
这次这么一套缜密的规划肯定能大干一场嘿嘿😏（其实一点都不缜密，当时同组的一起订了周四用流式细胞仪，不得不周二就准备48小时的那组，不然应该周三出48小时MTS数据再做的啊😓
Microplate reader啊，拜托给个好数据啊🙏
周一要连续准备三组MTS，这次我重新设计了实验，对药的溶剂和体积做出调整。我采用最最最保险的溶剂——细胞培养基。。之前还整那么多干啥，用培养基直接溶药不就是最保险的吗😎 还不用多加一组对照。（这么操作缺点就是怕培养基对药物的溶解度不够，但我后来算了算理论上是够的~
这次我二甲双胍设置了6个浓度10mM，5mM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM；5-FU我设置了5个浓度5mM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM；然后再加一个空白对照，刚好一行12个；然后癌细胞HT-29和正常细胞CAL-1都做。嘿嘿，为期四天的大工程启动啦！
这是我当时溶药溶出来的高浓度原液(stock solution)，左边两管是用DMSO溶的，放-20℃给冻住了🧊，右边一管是用培养基溶的。
我加药时都是从这原液稀释到相应浓度再加的。
为了讲清楚关于第三周MTS的大工程，我做了张表格，如下图所示。。即为具体96孔板上不同细胞不同药物不同时间如何如何安排接种的，当然每组实验都duplicate了，所以一共相当于用了48×3=144个孔。
我就先讲讲这一周所得的MTS数据，后面再讲流式细胞术的数据吧
这一周的数据太重要了，我后面几乎全用到论文里了。
周二的时候我便得到了第一组的24小时MTS的数据，如右图所示。
二甲双胍的数据有点奇怪。在癌细胞这好像不同浓度都是存活百分之七八十，这数据真的是有些太奇怪了😕 我怀疑这里有一定程度的污染(Contamination)。。培养瓶里的细胞好像没啥事，应该是在96孔板上被轻微污染到了，导致不同浓度下都死得很平均☹️ 不过我还是打算看看后面48小时和72小时的数据怎么样。至于在正常细胞的数据就比较正常一些😊 细胞存活率随药浓度升高而降低，在低浓度下几乎就不杀细胞了。
5-FU的数据直接证明了高浓度5-FU对细胞的杀伤力，在5mM时癌细胞甚至死到剩18.57%，简直是片甲不留啊😅 但低浓度的5-FU效果好像就没有那么明显，甚至正常细胞还好像死了那么多一点😓
总的来说，24小时这组数据虽然有些收获，还是存在些问题的，尤其是二甲双胍对癌细胞的实验组中，不过还是看看后面48小时和72小时的数据再做进一步打算。
持续更新… To be continue…
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