写在前面：这一篇来讲讲Western blot。Western blot算是检测蛋白的gold standard吧，原理说起来是挺简单的，就是分离蛋白然后抗体给它显出来，但实际操作起来步骤多又繁琐，一个步骤出错就可能导致没结果，两三天的工作直接白干😵。所以这一篇就好好讲讲Western blot的每个步骤以及要注意的事项。
Reagent Preparation
做Western blot之前当然要先把各种要用到的溶液给配好了，包括制作gel需要的1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)，0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)；裂解细胞要用的lysis buffer；跑gel的loading dye，running buffer；转膜的transfer buffer；洗膜的washing buffer。。。把这些东东配好就是Western blot成功的前提😇
其中running buffer, transfer buffer, washing buffer因为用量大，所以每次都是配一桶8L全实验室共用的，其他的reagent就都是自己配的了。
配方如下：
• 1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)：91g Tris base + 400ml ddH2O → 加HCl调pH到8.8 → 加ddH₂O到500ml
• 0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)：30g Tris base + 400ml ddH2O → 加HCl调pH到6.8 → 加ddH₂O到500ml
• Lysis buffer：20ml 1.0 M Tris (pH=8.0) + 12ml 5.0 M NaCl + 1g Sodium Deoxycholate + 4ml 10% SDS + 4ml NP-40 → 加ddH₂O到400ml
• Loading dye：200.0 mM Tris-Cl (pH=6.8), 400.0 mM DDT (can skip adding this if 2-mercaptoethanol is used), 8.0% SDS, 0.4% Bromophenol Blue, 40.0% Glycerol
Protein Extraction
既然是检测蛋白，当然要先把protein给extract出来了，裂解细胞有不同的方法，我们实验室用的是sonication（声波裂解法）来裂解细胞，这里就讲讲这种方法。
首先，细胞收起来后我一般先用PBS洗一遍，这样把medium洗掉就感觉干净些😂接着就加lysis buffer和protease inhibitor (PI)，PI的作用是防止蛋白降解，一般配成25×的PI，然后要用的时候lysis buffer和PI按24:1的比例加。Lysis buffer和PI的量取决于cell pellet的大小，如果细胞多点可能五六百μl，少点可能两三百μl，这就得看经验了，不然准备出来的蛋白浓度可能过高或过低。Lysis buffer和PI加到细胞后就可以拿去sonication了💢。
Sonication之前要先关好门戴上耳机🎧，因为这玩意儿声音非常刺耳。Sonication也是有技巧的，把sonicator伸到sample里面不能太靠近液面，不然sample马上就变成一管泡沫🤯，也不能乱晃，因为会碰到管壁。所以最好是把sonicator伸到液体底部，手要拿稳不碰壁🧪。Cell pellet大的话我一般会sonicate久点，三四十秒甚至一分钟，但问题是sonication的过程会产生热量，会导致裂解出来的蛋白变性，所以肯定不能一次性拿着sonicate三四十秒的。一个sample我一般会sonicate几秒钟，放回冰上，先去sonicate其他sample，等凉下来了再又sonicate，直到每个sample总时长达标。我个人有个习惯，就是加200μl lysis buffer就sonicate20秒，300就30秒，400就40秒，虽然也不绝对但有点参考价值吧📝。
图为我正在进行sonication，手千万要拿稳了🤌每换一个sample都得拿酒精喷一喷，擦干，不然就cross contaminate了
Sonication完之后就是离心，把细胞裂完后的杂质给去除掉，这个离心要狠点，我一般是调18000rpm十分钟，这样应该能把杂质给离心出来了，然后把上清液移到新管里就算完成protein extration了，接着就可以冻上（-20℃）或者去量蛋白浓度了。
Protein Concentration and Sample Preparation
Western blot之前还得先量好蛋白的浓度，这样确保跑的时候每个sample加的蛋白量是一样的🧪。量蛋白是用BCA assay量的，具体讲就是BCA和铜离子会和蛋白反应，用颜色变化来确定蛋白浓度。
要量蛋白浓度前首先的先配置一组Standard，就是不同确定浓度的蛋白（用BSA，Bovine Serum Albumin），之后系统量吸光度的时候会根据Standard所生成的曲线来确定所量蛋白的浓度，Standard配方如下：
| Final Concentration (μg/μl) | μl of 2μg/μl of BSA | μl of water added |
|---|---|---|
| 1.5 | 150 | 50 |
| 1 | 100 | 100 |
| 0.5 | 50 | 150 |
| 0.2 | 20 | 180 |
| 0.1 | 10 | 190 |
| 0.05 | 5 | 195 |
配好Standard后，就在96孔板上加Standard和sample，习惯总量是25μl。所以Standard加25μl，分别加两次于一二排。而sample稀释十倍，所以是加2.5μl的sample和22.5μl的水，分别加三次于第三排往后的孔里。
加好Standard和sample后，便是加BCA reagent，是现配的，每200μl的Reagent A加4μl的Reagent B，混好后每个孔加200μl。加好后将96孔板放37℃里15-30分钟，就可以拿去测吸光度了🪄（可以看到蛋白浓度越高越紫，如上图的紫色），系统根据吸光度就可以算出sample的蛋白浓度。
蛋白浓度量好后就可以根据蛋白浓度准备sample跑Western blot了。每个sample都应根据测出的蛋白浓度取出等量的蛋白，比如有一个sample测出的浓度是2.942μg/μl，如果要取50μg出来的话就要取17μl = 50/2.942来准备sample。这样取完后，每个sample要再加一定量的lysis buffer让每个sample的体积相等。然后每个sample还要加总体积量1/4的4×SDS loadig dye。听着有点复杂😂，但可以做张表，按着表加就行了：
这里以总量40μl，蛋白量50μg为例
| Sample | Sample 1 | Sample 2 | Sample 3 |
|---|---|---|---|
| Conc. (μg/μl) | C1 | C2 | C3 |
| Vol (for 50μg) | 50/C1 | 50/C2 | 50/C3 |
| Lysis buffer (μl) | 40-10-50/C1 | 40-10-50/C2 | 40-10-50/C3 |
| Loading dye | 10μl | 10μl | 10μl |
| Total | 40μl | 40μl | 40μl |
配好的sample可以在室温里放很久，但别放到冰箱里，因为loading dye里是有SDS的，温度一降就会析出📉。
Sample要用前放到100℃里五分钟让蛋白变性，如上图所示，加水沸腾♨️然后放上sample，要刚好五分钟，太长太短都有可能导致Western blot失败。
Gel Preparation
| Gel Percentage | ddH₂O (ml) | Acrylamide/Bis (ml) | Gel Buffer (ml) | 10% SDS (ml) |
|---|---|---|---|---|
| 4% | 6.1 | 1.3 | 2.5 | 0.1 |
| 5% | 5.7 | 1.7 | 2.5 | 0.1 |
| 6% | 5.4 | 2 | 2.5 | 0.1 |
| 7% | 5.1 | 2.3 | 2.5 | 0.1 |
| 8% | 4.7 | 2.7 | 2.5 | 0.1 |
| 9% | 4.4 | 3 | 2.5 | 0.1 |
| 10% | 4.1 | 3.3 | 2.5 | 0.1 |
| 11% | 3.7 | 3.7 | 2.5 | 0.1 |
| 12% | 3.4 | 4 | 2.5 | 0.1 |
| 13% | 3.1 | 4.3 | 2.5 | 0.1 |
| 14% | 2.7 | 4.7 | 2.5 | 0.1 |
| 15% | 2.4 | 5 | 2.5 | 0.1 |
| 16% | 2.1 | 5.3 | 2.5 | 0.1 |
| 17% | 1.7 | 5.7 | 2.5 | 0.1 |
| *Resolving Gel buffer: 1.5M Tris-HCI, pH 8.8 | ||||
| *Stacking Gels Buffer: 0.5M Tris-HCI, pH6.8 | ||||
讲完Protein sample的准备后，接着就该讲讲怎么做胶了🙇♂️，咳咳。跑Western blot的胶叫SDS-PAGE，中文应该叫聚丙烯酰胺凝胶。胶分为上下两部分，下层是Resolving gel （分离胶），是胶的主体部分；上层是Stacking gel（浓缩胶），就是梳子的那个部分。
做胶前要先把玻璃板洗干净，洗到“一层水膜，既不聚成液滴，也不成股流下”（怎么感觉回到了初中化学😂）。洗好晾干后，前后玻璃板对齐好然后夹紧，要确保不漏液💦。我们一般习惯用1.5mm厚的，也有1mm厚或不同规格的，这样可以加载sample的量不一样。
准备好玻璃板后，就可以按照表中的配方配胶了📜，一般最常用的是8%，10%，12%的胶（如表中加粗），蛋白大点比如100kDa就用8%的胶，蛋白小点比如30kDa就用12%的胶，如果蛋白更小（<20kDa）就会用15%的胶。
Resolving gel按表中配方加H2O，acrylamide，gel buffer，和10%SDS后，还得再加100μl的20%APS和10μl的TEMED。APS和TEMED加下去后胶就会慢慢开始凝固了，所以动作不能拖拉，加完APS和TEMED晃均匀后就把胶倒到玻璃板间🫗，倒满整个主体，留一个梳子多一些的高度，大概就倒到图中绿色架子的那条线的地方。这时候上面可能会有些小泡泡🫧，所以在上面加一层甲醇，泡就消掉了。
等个十来分钟⌛️，可以看到管里刚才倒剩的液体凝固，然后就可以加stacking gel了。Stacking gel是按4%的胶配的，但gel buffer不一样，stacking gel用的是pH6.8的那个。倒stacking gel前记得先把刚才加的那层甲醇给倒掉，然后剩下的空间用stacking gel倒满。倒满后再把梳子插下去，这样就不会出现气泡问题了🫧。
加完stacking gel之后再等个十来分钟等胶完全凝固，好了后要把玻璃板上残留的胶给洗掉🚿，把梳子拔出来，把每个孔里残留的水给吸出来，就可以拿组装跑胶了。
如果做好的胶不马上用的话，可以用湿纸巾包住，然后外面用保鲜膜包好📩（防止胶干掉，没错，就是超市买的保鲜膜），放到4°C冰箱里。一般我最多就放个一晚上，隔天用，因为放久了胶发生什么变化谁也不知道🤷♂️。
图中是我做的胶，可以看到管里剩余的已经凝固成胶了，这时候就能洗洗拿去用了
做胶最容易出的问题一般是漏胶💦，一般是由于前一次做胶玻璃板下那块灰色的垫子没洗干净，上面还有凝固的小颗粒，导致玻璃板夹不紧，胶倒下去就从缝隙里流出来了。所以每次做完胶要尽快洗干净，不然下一个人做就会漏胶😬。
图中是我做的胶，可以看到管里剩余的已经凝固成胶了，这时候就能洗洗拿去用了
Gel Electrophoresis
有了sample做好胶之后就可以准备开始跑胶了🏃♀️。首先要把设备组装起来，胶先装到gel holder上然后再放到tank里加running buffer。组装这个也是要小心的，先把玻璃板插到gel holder上，然后再慢慢推上去，可以看到上面两个角玻璃凸出来的地方和gel holder上的橡胶压实了，再合上两边的锁 。这个力度得控制好👇，压得太用力玻璃很容易会碎掉。一个gel holder可以放两块胶，如果只跑一块胶另一边用一块塑料板代替。
如图所示圈出来的两个地方就是需要压实的，不然两块板之间的running buffer就会流出来，越跑越慢💨
组装好的gel holder cassette放到tank里，然后倒入running buffer🫗。两块板之间要倒满running buffer，然后tank里就倒到2gel的那条线（不管一块两块）。如果gel holder没组装好，板之间的running buffer就会流出来💦，就没法跑电泳了。这时候可以拿出来重新组装⟳，如果实在还不行的话，可以索性tank里倒满running buffer，就是4gel那条线的位置。但tank里倒满running buffer，板之间的液面其实还是不是完全满的，这样跑电泳就会慢很多🐌。
如图所示板之间的running buffer加得满满的，然后外面tank里加到2 gel那条线。
Running buffer的配方：
1L 1× Running buffer = 900ml ddH₂O + 100ml 10× Running buffer
8L 10× Running buffer = 242.4g Tris base +1152g Glycine + 400ml 20%SDS + ddH₂O → 8L
组装好设备后就可以加sample了，千万记得前面说的每个sample加之前在100℃里放五分钟！加的时候每个sample用细的吸管全吸出来，然后伸到每个well里加进去。这时候手一定要拿稳了✊，慢慢加进去，不然一搅动sample从well漂出来，well之间就互相contaminate了。
除了sample外还得加个ladder作为标记🪜，ladder的量是3μl，所以如果sample总量是40μl的话，就以3μl ladder + 27μl lysis buffer + 10μl loading dye作为ladder，让ladder的总量和sample一样。
加好sample后盖上盖子就可以开始跑了，记得红的对红的，黑的对黑的，不然就反着跑了😂。启动电源后可以看到板之间有泡泡往上漂🫧，那就是开始跑了。一般刚开始跑的时候电压为90或100V，跑一半的时候可以升高到110V，到后面可以再升高到120V⚡️。而且跑的时候板之间的液面会慢慢慢慢地降一小点，所以我会中途暂停往中间倒running buffer让它跑快点🏃。按上述电压的话，一般大概跑两个小时（不同浓度的胶速度不同）。
跑到loading dye从胶里出来到tank里就算完成了🔚，这时候记得及时关，不然继续跑就把里面的蛋白给跑没了，尤其是小分子量的蛋白。或者实在不放心，loading dye跑到底部可以停了，再把有loading dye部分的胶切掉，不过感觉这样跑出来的条带就会细一点，因为蛋白跑开的程度小点。
Protein Transfer to Membrane
转膜是Western blot最容易出问题的一步
1L 1× Transfer buffer = 200ml Methanol 700ml ddH₂O + 100ml 10× Transfer buffer
8L 10× Transfer buffer = 242.4g Tris base +1152g Glycine + ddH₂O → 8L
Blocking and Primary Antibody Incubation
Washing buffer配方：
8L 1× Washing buffer = 800ml 10× TBS buffer + 8ml Tween-20 + ddH₂O
先加水到7L多再加Tween-20，然后再加水到8L，不然直接往Tween-20里加水会整出一堆泡来
4L 10× TBS buffer = 96g Tris base +352g NaCl + 3.8LddH₂O, pH7.6
Secondary Antibody Incubation
Detection
持续更新中。。。Continuing…