Western Blot - 探赜之路

写在前面：这一篇来讲讲Western blot。Western blot算是检测蛋白的gold standard吧，原理说起来是挺简单的，就是分离蛋白然后抗体给它显出来，但实际操作起来步骤多又繁琐，一个步骤出错就可能导致没结果，两三天的工作直接白干😵。所以这一篇就好好讲讲Western blot的每个步骤以及要注意的事项。

Reagent Preparation

做Western blot之前当然要先把各种要用到的溶液给配好了，包括制作gel需要的1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)，0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)；裂解细胞要用的lysis buffer；跑gel的loading dye，running buffer；转膜的transfer buffer；洗膜的washing buffer。。。把这些东东配好就是Western blot成功的前提😇

其中running buffer, transfer buffer, washing buffer因为用量大，所以每次都是配一桶8L全实验室共用的，其他的reagent就都是自己配的了。

配方如下：

• 1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)：91g Tris base + 400ml ddH2O → 加HCl调pH到8.8 → 加ddH2O到500ml

• 0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)：30g Tris base + 400ml ddH2O → 加HCl调pH到6.8 → 加ddH2O到500ml

• Lysis buffer：20ml 1.0 M Tris (pH=8.0) + 12ml 5.0 M NaCl + 1g Sodium Deoxycholate + 4ml 10% SDS + 4ml NP-40 → 加ddH₂O到400ml

Protein Extraction

既然是检测蛋白，当然要先把protein给extract出来了，裂解细胞有不同的方法，我们实验室用的是sonication（声波裂解法）来裂解细胞，这里就讲讲这种方法。

首先，细胞收起来后我一般先用PBS洗一遍，这样把medium洗掉就感觉干净些😂接着就加lysis buffer和protease inhibitor (PI)，PI的作用是防止蛋白降解，一般配成25×的PI，然后要用的时候lysis buffer和PI按24:1的比例加。Lysis buffer和PI的量取决于cell pellet的大小，如果细胞多点可能五六百μl，少点可能两三百μl，这就得看经验了，不然准备出来的蛋白浓度可能过高或过低。Lysis buffer和PI加到细胞后就可以拿去sonication了💢。

Sonication之前要先关好门戴上耳机🎧，因为这玩意儿声音非常刺耳。Sonication也是有技巧的，把sonicator伸到sample里面不能太靠近液面，不然sample马上就变成一管泡沫🤯，也不能乱晃，因为会碰到管壁。所以最好是把sonicator伸到液体底部，手要拿稳不碰壁🧪。Cell pellet大的话我一般会sonicate久点，三四十秒甚至一分钟，但问题是sonication的过程会产生热量，会导致裂解出来的蛋白变性，所以肯定不能一次性拿着sonicate三四十秒的。一个sample我一般会sonicate几秒钟，放回冰上，先去sonicate其他sample，等凉下来了再又sonicate，直到每个sample总时长达标。我个人有个习惯，就是加200μl lysis buffer就sonicate20秒，300就30秒，400就40秒，虽然也不绝对但有点参考价值吧📝。

图为我正在进行sonication，手千万要拿稳了🤌每换一个sample都得拿酒精喷一喷，擦干，不然就cross contaminate了

Sonication完之后就是离心，把细胞裂完后的杂质给去除掉，这个离心要狠点，我一般是调18000rpm十分钟，这样应该能把杂质给离心出来了，然后把上清液移到新管里就算完成protein extration了，接着就可以冻上（-20℃）或者去量蛋白浓度了。

Protein Concentration and Sample Preparation

Western blot之前还得先量好蛋白的浓度，这样确保跑的时候每个sample加的蛋白量是一样的🧪。量蛋白是用BCA assay量的，具体讲就是BCA和铜离子会和蛋白反应，用颜色变化来确定蛋白浓度。

要量蛋白浓度前首先的先配置一组Standard，就是不同确定浓度的蛋白（用BSA，Bovine Serum Albumin），之后系统量吸光度的时候会根据Standard所生成的曲线来确定所量蛋白的浓度，Standard配方如下：

Final Concentration (μg/μl)	μl of 2μg/μl of BSA	μl of water added
1.5	150	50
1	100	100
0.5	50	150
0.2	20	180
0.1	10	190
0.05	5	195

配好Standard后，就在96孔板上加Standard和Sample，习惯总量是25μl。所以Standard加25μl，分别加两次于一二排。而Sample稀释十倍，所以是加2.5μl的Sample和22.5μl的水，分别加三次于第三排往后的孔里。

加好Standard和Sample后，便是加BCA reagent，是现配的，每200μl的Reagent A加4μl的Reagent B，混好后每个孔加200μl。加好后将96孔板放37℃里15-30分钟，就可以拿去测吸光度了（可以看到蛋白浓度越高越紫，如上图的紫色），系统根据吸光度就可以算出Sample的蛋白浓度。

蛋白浓度量好后就可以根据蛋白浓度准备Sample跑Western blot了。每个Sample都应根据测出的蛋白浓度取出等量的蛋白，比如有一个Sample测出的浓度是2.942μg/μl，如果要取50μg出来的话就要取17μl = 50/2.942来准备Sample。这样取完后，每个Sample要再加一定量的Lysis buffer让每个Sample的体积相等。然后每个Sample还要加总体积量1/4的4×SDS Loadig dye。听着有点复杂😂，但可以做张表，按着表加就行了：
这里以总量40μl，蛋白量50μg为例