Cell Culture - 探赜之路

写在前面：作为该专题的第一篇，肯定得讲最重要的东西了——怎么养细胞🧫。要是细胞都养不活那后面的实验就都不用做了😂。。不同的细胞特性不一样，养的方式自然也不一样，不过大抵上是有个general procedure的，听我一一道来。

养细胞前 Before Culturing Cells

① Biosafety Cabinet (BSC, 生物安全柜)
所有关于cell culture的实验都必须在Biosafety Cabinet内进行。用之前要先穿好实验服🥼，戴好手套🧤，袖口用胶带扎起来，双手用酒精消好毒。打开BSC并开灯后，工作台得用酒精擦一遍，所有要进入BSC的物品都得用酒精喷一遍，包括双手。如果手从里面出来又要进去，要再喷一遍，千万别嫌麻烦。如果这些杀菌消毒步骤没做好，细胞马上就能死给你看😵。

② Cell Culture Medium (细胞培养基)
比较常见的培养基有如DMEM，RPMI-1640……不同的细胞对于培养基的要求不一样，比如，我现在有在养的LNCaP细胞就需要RPMI-1640，Du145细胞就需要DMEM；如果用DMEM养LNCaP细胞，LNCaP是长不活的（以前不信邪，传细胞的时候试过😅）。有些细胞甚至比较挑剔，要特定的抗生素，或特定的什么配方。所以呀，养细胞前一定要先查查养的细胞要用什么培养基配方。
我们首先拿到的是Basal Medium (基础培养基，如图)，但肯定不能直接拿来养细胞的，培养基要用前要先过滤 (如图)，然后加补充物🧪。正常一定要加的是10% FBS (Fetal Bovine Serum, 胎牛血清)，有些实验室会加抗生素防止细菌污染🦠，但我们实验室是不加的，这就考验大家的技术了，杀菌工作一定要做好。
配好的培养基可以放在4℃冷藏，要用前放37℃水浴热上。

③ Other Materials (其他材料)
其他要用的试剂包括：Trypsin (Trypsin-EDTA, 0.25%, 胰蛋白酶)，PBS (Phosphate Buffered Saline, 磷酸缓冲盐水)
要用的器材包括但不限于：各种tubes，各种culture plates/dishes/flasks，各种pipettes，incubator (37℃, 5% CO2)，waste asperting system，water bath，ice……
新的袋装的器材要在BSC里面才能打开，用完用胶带封好才能拿出来，各种瓶瓶罐罐的要用autoclave过的。

Basal Medium

Medium先filter，并加10%FBS

常见养细胞布置如图（我的习惯是这样↑，每个人习惯可能不一样，但sterilize工作一定得做好）

细胞传代 Cell Passaging

这是我正养着的两盘Du145细胞

我一般会写上细胞类型，日期，和细胞的用途（keep，for transfection, for freezing, new-thaw…)

细胞传代是养细胞的关键步骤，一般一盘细胞长到70-90%传下一代。所以养细胞时要每天都要看看细胞的状态🔬，太满或太久没换培养基的话细胞就死翘翘了，而且每天观察一下也能确保细胞没被contaminate。我现在养的细胞都是贴壁长的，如果哪天看到全浮在培养基里，那就是挂了😂

标准的cell passaging过程如下：首先先用细玻璃吸管吸走旧的培养液，接着缓慢地加PBS轻轻地洗一遍细胞。吸走PBS后加一两毫升的trypsin，放回incubator里等个三分钟⏱️，这个过程是让trypsin消化蛋白让细胞从盘上脱落。细胞脱落后往里加入一定量的培养基停止酶的反应（我习惯是加到十毫升），给它混匀并吸出到离心管里。然后1000 rpm 离心个三分钟，让细胞分离出来。吸走上清液后，用新鲜培养基重新混匀细胞。接着就是按你想要的比例种到盘里了，如果长得快的细胞可能传少点，稀释1:10甚至0.5:10；长得慢的可能多传点，二传十或者更高；这个步骤取决于不同细胞，还取决于你的实验安排，哪时候要细胞，要长快点还是慢点。。。种好细胞给它晃匀后放incubator等它长就行了。

我自己的做法呢，肯定很不标准啦😅(bushi。每个人习惯不一样，做法当然不同了。比如说吸走旧的培养基之后我经常不用PBS洗，直接加trypsin让它脱落，这也不是不行，就是得在incubator放久点或者trypsin量多点。对于一些特定的细胞系，像293T，Hela，或者DuNE，其实不用加trypsin，洗一下就掉，我也会跳过加trypsin的步骤直接离心。不过如果太久没用trypsin的话也会出问题的，细胞最后会结块，影响后续的实验。每个人的习惯也许不一样，但总的来说，传细胞不但要把手练熟了，也要对细胞的生长态势做好判断，让细胞长得符合你预期的效果是最好的。毕竟是我们在养细胞，而不是细胞在养我们😁

细胞冻存及解冻 Cell Freezing and Thawing

养细胞还有一个重要的步骤就是冻存和解冻细胞。不断冻细胞一来可以备份，防止现在养的细胞contaminate或挂掉💀；二来可以保证做实验细胞代数的稳定，不至于细胞养得老化掉，细胞性质都变了。

细胞一般冻存在-80℃或液氮里🥶，-80℃里还不够稳定，可以放个一两年；液氮里就几乎可以永远存着了。冻存细胞要配专门的freezing medium，📜配方为：40%养该细胞所用的medium + 50% FBS + 10% DMSO。

细胞冻存的具体步骤如下，首先先收细胞，并离心出cell pellet出来，然后用freezing medium打散，分装到冻存管（cryovial）里🧪，把冻存管装到freezing contianer里放到-80℃就ok了。如果要放液氮里，要先在-80℃放一晚，第二天再放液氮里，记得做好decumentation📝，记好是放在液氮罐的哪个位置。一般一盘满细胞的10cm盘可以冻存成3-4个管，每个管1.5ml；所以我一般的习惯是等一盘长满，离心之后加4.5ml freezing medium打散，然后分到三个管里，每个管都标好cell line，冻存时间，代数，特殊的修饰或treatment之类的。

图为我正要冻存的细胞

冻存细胞比较简单，反正丢冰箱里就冻上了，但解冻就得小心了，因为动作得快，一不留神整管细胞就死翘翘了😵‍💫。首先你得把BSC里要用的实验器材都给准备好，然后再去-80℃或液氮里把细胞拿出来（玩液氮的时候记得做好防护）。细胞拿来之后就马上放到37℃水浴里（用架子，注意管口别沾水），放一到两分钟！放一到两分钟！放一到两分钟！重要的事情说三遍😂。

在37℃里一到两分钟管里的冰就刚好融化，然后马上加medium然后centrifuge。细胞要刚刚好融化，甚至不用完全化开，中间有一小块冰也没事，直接倒离心管里加medium离心；但一定不能全融化了又放很久，这样整管细胞就死了！因为freezing medium里有10%的DMSO，还又加热，对细胞毒性挺大的😵。加完medium并centrifuge完后，把旧的medium吸掉，然后加新鲜的medium打散加到盘里就行了。一般刚解冻的细胞要先传一代才能做实验，因为这时候细胞状态不太好，实验结果自然不行，所以如图一般刚解冻的我会标上new-thaw，然后解冻完第二天换一次medium。

数细胞 Cell Counting

有些实验必须定量细胞的浓度，这时候就得数细胞🔢。我们实验室是用cell counter数的，用10µl的细胞与10µl Trypan blue混合然后加到counting slide里，有两个chamber，每个加10µl，然后插到cell counter就能自动数出来活细胞的浓度了。数出来两次结果取平均，如果结果差得太远那得多数几次。

有的实验室是用hemocytometer (血细胞计数板) 数的，这时候就得在显微镜下自己手动数每格多少活细胞，然后算出细胞浓度。

其他注意事项 Other Precautions

Cell incubator得保持37℃，5%CO2，所以二氧化碳罐用完要及时更换，以保证二氧化碳的供应。Incubator里也得保持湿度和无菌，所以一旦湿度不足，AquaClean溶液（5ml AquaClean + 1L 水）要及时加到底下的盘里（有些实验室用的硫酸铜或其他溶液）。
装废液的锥形瓶不能太满，太满容易通过吸废液的管道contaminate细胞。所有吸走的废液要加bleach充分灭菌后才能倒掉。不要的细胞也要加bleach静置半小时以上才能倒掉丢弃。
一旦发现contamination，要及时把细胞丢掉，然后消毒BSC和incubator。
每次传细胞做好记录，方便追溯细胞的代数，以确保细胞的性质大体不变。

养细胞的大致步骤就是这样吧，如果还有什么想起来的要点我就加在其他注意事项里。养细胞也不是什么玄学，养不活肯定是有哪个步骤让细胞不高兴了😂，多多留意每一步操作就是。作为细胞和分子生物学所有实验的基石，养细胞自然是重中之重的，必须熟练掌握的🤠~